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360百科——RNA病毒  

2014-09-30 09:30:52|  分类: 知识交流 |  标签: |举报 |字号 订阅

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RNA病毒


核糖核酸病毒,又称RNA病毒,其遗传物质为RNA,相较于DNA病毒,RNA病毒具有较高的变异性,因为它们缺乏修正错误的DNA聚合酶的能力。虽然RNA通常会很快地产生变异,但是和SARS相关的RNA病毒的遗传物质突变却较缓慢。

基本信息

  • 中文名称

    RNA病毒

  • 外文名称

    RNA virus

  • 别称

    RNA型病毒

 
  • 遗传物质

    有核糖核酸组成

  • 等级

    一级

目录
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1 基本简介编辑本段

RNA病毒RNA病毒RNA病毒(RNA virus) 也称RNA型病毒。核酸为RNA的病毒的总称。植物病毒,除少数例外(如花椰菜花叶病毒Caulif- lower mosaic virus),几乎都是RNA病毒。

冠状病毒直径为80~160nm,为有包膜的单股RNA病毒RNA的复制过程中,其错误修复机制的酶的活性很低很低,几乎是没有的,所以其变异很快;而疫苗是要根据病毒的固定基因或蛋白进行开发制作的。所以RNA病毒疫苗较难开发!只要记住相对少数的RNA 病毒例子就可以了。

2 基本种类编辑本段

RNA病毒有:烟草花叶病毒,SARS 病毒,西班牙流感病毒,甲型H1N1流感病毒,禽流感病毒噬菌体(有一部分噬菌体是DNA病毒,如T2噬菌体)等。

3 核酸类型编辑本段

3.1 ssRNA病毒的复制

有些ssRNA病毒,一旦病毒颗粒中的RNA进入寄主细胞,就直接作为mRNA,翻译出所编码的蛋白质,其中包括衣壳蛋白和病毒的RNA聚合酶。然后在病毒RNA聚合酶的作用下复制病毒RNA,最后病毒RNA和衣壳蛋白自我装配成成熟的病毒颗粒。这类病毒很多,如ssRNA噬菌体、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、TMV等。

还有另一类ssRNA病毒,它们的复制特点是病毒颗粒中的ssRNA病毒为负链,进入寄主后不能直接作为mRNA,而是先以负链RNA为模板由转录酶转录出与负链RNA互补的RNA,再以这个互补RNA作为mRNA翻译出遗传密码所决定的蛋白质。这类病毒称之为负链非侵染型病毒,如滤泡性口腔炎病毒、流感病毒、副流感病毒、莴苣坏死黄化病毒等。RNA病毒RNA病毒

此外,还有一类特殊的ssRNA病毒即反转录病毒。该类病毒通常引起人和动物的肿瘤,其中包括造成人免疫性缺陷症的爱滋病病毒、白血病病毒、肉瘤病毒等。在它们的髓核中携带反转录酶,能使RNA反向转录成DNA,丰富和发展了分子生物学的中心法则。它们的复制有其特有的特点,一是单链RNA的基因组必须反转录成双链DNA;二是随后这种DNA必须整合到细胞DNA中;三是整合状态长期持续下去并传给子代细胞,也可能转录RNA,生产子代病毒或使细胞转化;四是感染细胞不会死亡,分裂不停止。也就是说这类病毒的潜伏期很长,有时可以终身带毒而不发病。

3.2 双链RNA病毒的复制

双链RNA病毒有两个特点,一是它的基因组为10-12条双链RNA分子;二是它有双层衣壳,而没有囊膜。病毒的RNA-RNA 聚合酶存在于髓核中,在该聚合酶的作用下病毒基因组转录正链RNA,它们自髓核逸出。它们既能作为mRNA,又能作为病毒基因组的模板。MRNA翻译结构蛋白,装配内层衣壳后,正链RNA进入,并形成双链RNA。然后又重复上述过程,最后获得了外层衣壳。

综上所述,病毒复制的特点表现在:一是利用寄主细胞的物质和能量进行病毒生物大分子的合成;二是复制周期短,繁殖效率高;三是反转录病毒的复制方式,丰富了遗传信息传递的中心法则。

3.3 负链RNA病毒复制

负链RNA病毒复制的大致过程是:首先病毒通过其表面糖蛋白与宿主细胞的特异性受体结合,接着病毒囊膜与细胞浆膜(即通过不依赖于PH途径)或有酸性环境的核内体膜(PH依赖途径)融合后释放病毒核糖核蛋白复合体(RNP)至细胞浆,在转录过程中每一mRNA得以合成,而通过复制产生全长反义基因组RNA,使其作为病毒基因组RNA的模板。很多负链RNA病毒在感染细胞的胞浆中复制,而一些正粘病毒和布尼亚病毒在细胞核中复制。新合成的RNP复合体与病毒结构蛋白在细胞浆膜或高尔基体膜组装,然后释放新合成的子代病毒。

在动物正链RNA病毒的研究上,1996年,Meyers G等构建了猪瘟病毒,基因组全长cDNA克隆,将cDNA克隆体外转录后获得的RNA转染猪肾细胞后最终产生了有感染性的CSFV,虽然拯救出的带有遗传标记的CSFV比野生型生长能力上差一些,但仍具有感染性。这是较早的有关CSFV拯救的报道。

此外,有报道首先建立表达T7 RNA 聚合酶的猪肾细胞系SK6,然后将CSFV基因组cDNA克隆线性化后转染该细胞系,结果成功拯救出与野生型CSFV生物学特性一样的病毒,且病毒的效价比用体外制备转录本的方法高200倍,如对cDNA克隆不进行线性化直接用环型重组体进行转染,则拯救出的病毒效价高20倍[130]。此外,在CSFV疫苗株C株的反向遗传研究上已有很多报道,其中在对标记疫苗、病毒复制、毒力和宿主特异性等方面都有相关报道。

4 提取方法编辑本段

4.1 试剂准备

1、 TROzlo试剂、氯仿、75%乙醇(0.1% DEPC配制)。

2、 塑料器皿需用0.1% DEPC水浸泡。

3、 0.1%DEPC水:100ml dd水中加入DEPC0.1ml,充分振荡,37℃孵育12h以上,121℃高压灭菌20min,于4℃保存。

4.2 操作步骤

1、 样品处理

(1) 组织:50-100mg组织中加入1ml TROzlo试剂。

(2) 单层细胞:加入TROzlo试剂1ml/cm2平板。

(3) 悬浮细胞:处理前洗涤细胞,以防止RNA降解。每5-10×105动物、植物或酵母细胞,或1×107细菌加入1 ml TROzlo试剂。

2、 将上述样品于15-30℃静置5min,使核蛋白充分解离。

3、 加入0.2ml(1 ml TROzlo试剂)氯仿,盖紧盖子,充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。

4、 于2-8℃ 12000g离心15min。离心后样品分层,上层水相中含RNA,下层有机相中含蛋白和DNA。

5、 取上清,加入0.5ml异丙醇,轻轻混匀,于15-30℃静置10min后,在管底会出现胶状沉淀,即为RNA。

6、 于2-8℃ 12000g离心10min后弃去上清。

7、 向沉淀中加入1ml 75%乙醇,轻轻混匀。

8、 于2-8℃ 7500g离心5min后弃上清

9、 将RNA样品凉干(不要彻底干燥),加入适量DEPC水溶解(可于55-60℃促溶10min)。

5 相关信息编辑本段

5.1 装配

新合成的病毒核酸和病毒结构蛋白在感染细胞内组合成病毒颗粒的过程称为装配(Assembly),而从细胞内转移到细胞外的过程为释放(Release)。大多数DNA病毒,在核内复制DNA,在胞浆内合成蛋白质,转入核内装配成熟。而痘苗病毒其全部成份及装配均在胞浆内完成。RNA病毒多在胞浆内复制核酸及合成蛋白。感染后6个小时,一个细胞可产生多达10,000个病毒颗粒。

5.2 释放

病毒装配成熟后释放的方式有:(1)宿主细胞裂解,病毒释放到周围环境中,见于无囊膜病毒,如腺病毒、脊髓灰质炎病毒等;(2)以出芽的方式释放,见于有囊膜病毒,如疱疹病毒在核膜上获得囊膜,流感病毒在细胞膜上获得囊膜而成熟,然后以出芽方式释放出成熟病毒。也可通过细胞间桥或细胞融合邻近的细胞。

6 相关研究编辑本段

近年来,在分子病毒学研究领域兴起一门新型技术,即在RT-PCR和体外转录RNA技术基础上建立起来的全长感染性cDNA克隆技术,也叫反向遗传操作技术(reverse genetics manipulation ),又名“病毒拯救(rescue of virus)”,它解决了对病毒基因组RNA难以操作这一难题。从cDNA克隆拯救出负链RNA全病毒是90年代分子病毒学研究领域最振奋人心的突破之一,它开启了人们对病毒基因组进行人工操作以及详细了解病毒基因及其产物功能的大门。该技术发展迅速,倍受国内外研究者关注。

与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思路相反,反向遗传操作技术是指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆,将病毒基因组RNA逆转录成cDNA,在DNA分子水平上对其进行体外人工操作,由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项技术。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆,因此,可通过中间过程中人为加入的DNA环节,在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作,如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补(即构建嵌合病毒)等改造,以此来研究RNA病毒的基因复制和表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系(如插入报告基因来研究病毒在宿主细胞间的传递机制)、抗病毒策略、基因治疗研究以及构建新型病毒载体表达外源基因和进行疫苗的研制等。

1976年Goff S. P等首先报道成功拯救出SV40 DNA病毒突变株,虽然拯救出的不是RNA病毒,但这是最早的有关病毒拯救的报道。1978年,Taniguchi T 等报道从全长cDNA克隆拯救出在细菌中有感染性的Qβ噬菌体。接着,基因组长约150kb的单纯疱疹病毒和长约190kb的痘苗病毒的重组病毒的成功拯救及有关研究是病毒学研究的领域重大突破。为在早期反向遗传操作体系的建立奠定了基础。

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